通过双gRNA进行可预测的高效基因编辑

CRISPR基因编辑是通过使用内源DNA修复机制修复Cas9引入的双链断裂（DSB）来完成的。尽管对于给定的CRISPR指导RNA（gRNA），DSB修复的结果是可预测的，但在不同的靶位点之间它是不同的。在这里，我们报道了由Cas9和一对gRNA引入的缺失连接是可预测的发现。我们研究了在三个人类细胞系中靶向四基因（TTR，CREB1，STAT2和IRF9）的8对gRNA的修复连接。使用Sanger和二代测序和ICE分析，我们发现缺失连接主要由非同源平末端连接（NHBEJ）修复。我们进一步评估了24个CRISPR缺失接头的插入缺失谱，以证实这一观察结果，并进一步证明了CRISPR对之间的PAM方向和距离对NHBEJ结果有轻微影响。基于这些观察结果，我们应用NHBEJ策略引入了高度精确且可预测的基因敲除和DMD外显子51的框内缺失，为杜兴氏肌营养不良症和许多其他人类疾病的CRISPR基因治疗提供了一种新颖的替代治疗策略。